荔园非编码RNA平台——miRNA的qPCR检测
实验原理
通过qPCR准确进行miRNA在细胞或组织样本中的表达分析是研究miRNA功能的基础。将小片段的miRNA通过聚合酶A加尾，再通过含有通用序列的Oligo序列进行反转录，合成特异性的miRNA引物及通用引物即可对miRNA进行qPCR检测工作。（见下图）
图1 miRNA的qPCR检测原理示意图
技术应用
研究miRNA与疾病的相关性，开发miRNA作为疾病诊断及治疗生物标志物。
实验流程
实验结果实例
图1 目的基因hsa-miR-9-1 在不同样本中的qPCR相对定量检测结果的
1）目的基因hsa-miR-9-1 的扩增曲线和熔解曲线；2）内参基因人 snRNA U6的扩增曲线和熔解曲线；
3）hsa-miR-9-1 在不同样本中的qPCR相对定量检测柱形图。
TROUBLESHOOTING
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实验问题 |
原因 |
推荐解决方法 |
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溶解曲线出现杂峰？ |
RNA被基因组DNA污染 |
用DNase处理样本。 |
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引物二聚体 |
降低引物使用浓度。 |
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非特异性扩增 |
冰上配置，降低模板量，提高退火温度。 |
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扩增产物量少？ |
靶miRNA基因表达量低或者无表达 |
增加高表达miRNA的阳性对照样本以验证反应体系。 |
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模板量低 |
提高模板量或增加循环数。 |
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扩增曲线不正常？ |
反应体系中存在酶抑制导致PCR酶失活 |
重新抽提RNA，注意反应体系匆引入酶抑制剂。 |
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染料降解 |
更换荧光定量PCR反应体系。 |
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模板质量问题 |
提高模板的纯度。 |
常见问题 FAQ
Q ：如何选择miRNA荧光定量PCR的阳性对照样本？
A ：请参考相关文献确认高表达miRNA的细胞作为阳性对照细胞，以验证特异性引物的设计没有问题。
Q ：miRNA荧光定量PCR选用何种基因作为内参基因?
A :起始样本量、PNA制备和定量、反转录效率的差异都可能导致荧光定量PCR的误差，内源性对照基因是纠正初始样本量，反转录效率的最准确的方法。
Small nuclear RNA (snRNA)和small nucleolar RNA (snoRNA)长度与miRNA相近，200bp左右，在多种组织、细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，且引物设计方法相同，都是很好的内参选择，如最为常用的miRNA内参基因为snRNA U6。
Q ：提供的miRNA的qPCR引物设计有何特点？
A ：由于miRNA本身片段短，设计有局限性，因此miRNA的qPCR引物设计要求比普通qPCR要求，我们可以为您设计合成特异性更高、扩增效率更高的引物，并且各个引物Tm值均一、扩增片段性质均一，所有引物可采用同一反应条件进行扩增。
参考文献
1.Suzuki T, Higgins PJ, Crawford DR. Control selection for R N A quantitation. Biotechniques 2000,29(2):332-337.
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