荔园非编码RNA平台——ncRNA与外泌体研究
ncRNA与外泌体研究介绍
外泌体是由细胞膜内陷形成内体，然后再形成多泡体，最后分泌到胞外，目前的研究发现外泌体中携带有细胞的多种成分，包括蛋白质、脂类、DNA和RNA等，携带重要的生物信号。本期我们重点关注外泌体中非编码RNA的研究。外泌体中携带的非编码RNA信息包括miRNA、lncRNA、circRNA，这些非编码RNA在细胞间信息传递，调控基因表达等方面有着重要作用；对外泌体中的miRNA、lncRNA、circRNA进行研究不仅能够深入了解疾病或不同发育阶段的内在机制，而且筛选外泌体特异biomarker也有着非常高的临床应用价值。
外泌体和外泌体RNA的提取
Exosome是由活细胞分泌的一种亚细胞成分，组要成分是磷脂双分子和携带的膜性分子。目前分离exosome的金标准为超速离心法。除此，目前研究者亦可采用磁珠免疫捕获、沉淀或过滤的方法对exosome进行前期的分离。最近几年，已经一些有成熟的外泌体提取试剂盒上市，这些试剂盒不需要特殊设备，可以非常方便快捷地提取外泌体及其所携带的RNA。此类试剂盒中，有的是利用特殊设计的过滤器过滤掉非外泌体成分，同时把外泌体中的RNA成分释放出来，直接用于接下来的实验；有的则是高分子聚合物的体积排阻效应，把外泌体沉淀出来。但是，也有研究者认为，这种方法的特异性不佳，无法区分真正的外泌体和其他非外泌体微小颗粒。
外泌体RNA研究策略
差异筛选
随着高通量技术的不断发展，目前对于外泌体RNA的研究也已经进入新的阶段。对于不同类型的外泌体RNA（mRNA、lncRNA或miRNA等），在功能探索方面会有所不同，但与一般的RNA分子功能研究方法并无本质区别。完成外泌体及其所包含的RNA分子提取后，可进一步选择高通量技术进行大规模差异筛选，目前用于RNA差异筛选的高通量技术手段主要为高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）及生物芯片。生物芯片通过参考已有的数据信息，针对每个转录本（lncRNA、miRNA或mRNA）设计探针，通过探针和转录本反转录产生的cDNA之间的杂交，判断不同样本之间的转录本表达差异。生物芯片本质上是核酸杂交，整个芯片系统也是一个封闭的系统，不能检测探针没有覆盖到的区域；而近些年来逐渐发展起来的NGS，是一个开放的系统，理论上讲，按照流程，不管有没有参考序列信息，都可以进行检测（denovo和re-sequencing）。所以，生物芯片不能发现新的转录本，而NGS则可以发现一些未知转录本。
数据分析
对于外泌体RNA数据分析内容，本质上与其他RNA研究方法一致。对于miRNA，分析内容主要包括外泌体与分泌细胞间、外泌体与受体细胞间、正常细胞外泌体与病变细胞外泌体间、病变细胞外泌体与正常细胞间miRNA表达差异分析、miRNA表达聚类分析、外显子/内含子注释等，高级分析包括miRNA靶基因预测、miRNA碱基编辑分析、miRNA调控网络构建等内容。特别是针对外泌体miRNA的研究，由于里面包含的miRNA数量较多，往往在功能是起到协同作用，因此利用exosome miRNA调控网络分析，更容易获得外泌体中miRNA的宏观生物学功能及主要miRNA成分的靶基因信息。
功能探索
差异筛选与生物信息分析完成后，需要对所获得的差异RNA进行功能和调控机制上的探索。功能研究主要包括功能获得（gain of function）和功能缺失（loss of function）研究。外泌体主要参与胞间通讯，研究外泌体中RNA对于受体细胞的影响，可以使用外泌体与受体细胞共同孵育，利用FISH、FACS等技术检测外泌体中RNA分子进入受体细胞的机制与过程，但是要区分受体细胞变化是否真的是由于外泌体RNA所引起，而非自身RNA变化所导致，可使用RNAi等方法构建RNA缺陷细胞，再使用外泌体进行孵育，观察突变细胞变化。对于外泌体miRNA研究，也可借助荧光素酶报告质粒，通过检测受体细胞与外泌体孵育后的荧光变化，确认外泌体miRNA是否进入细胞。还有一种方法就确定外泌体所存在的miRNA分子后，可以通过化学合成带荧光标记的模拟物，转染进外泌体供体细胞，然后收集供体细胞所分泌的外泌体，加入到受体细胞培养体系中，几个小时后可以通过荧光显微镜或者流式细胞术检查受体细胞是否存在荧光信号，以此判断受体细胞分泌的exosome是否进入到受体细胞里面。研究者可根据实际研究需要，合理设计验证实验。对于外泌体对受体细胞的影响，可使用qPCR、测序和芯片、WB等技术手段检测受体细胞中其他基因变化，分析通路影响及细胞表型变化（增殖、凋亡、侵袭转移等），以确认外泌体RNA功能。而对于外泌体RNA的调控机制研究，从目前已有研究结果来看，分泌细胞中RNA转录上升并不足以驱动外泌体RNA产生差异，这个过程依然有其他机制参与。目前认为，受体细胞的某些变化会促使一些RNA分子从分泌细胞被特异性地分选进入外泌体，再经过循环系统到达受体细胞。因为这个特性，外泌体RNA分子可以成为某些疾病的血液标志物，用于早期诊断和治疗。
典型案例
1.外泌体与lncRNA
外泌体是30-150nm具有膜结构的分泌性囊泡结构，外泌体很容易从包括尿液在内的体液中分离出来。外泌体中包含母细胞的蛋白质、miRNA、mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）。虽然已有报道从血浆中分离出的miRNA、lncRNA和蛋白质可作为良性或恶心疾病的潜在生物标志物，但是在膀胱癌患者尿液是否存在相关的生物标志物还不清楚。lncRNA是一类长度大于200bp且不具备编码蛋白能力的RNA，在肿瘤生物学中发挥着关键作用，与肿瘤相关的lncRNAs的数量不断增加，同时需要开发lncRNAs标志物和治疗方法。之前报道中lncRNA HOTAIR已经显示出促进肿瘤发生发展和影响肿瘤不良预后的作用，HOTAIR在癌症生物学中的重要性已经引起大家使用HOTAIR作为生物标志物和潜在的治疗靶点的广泛兴趣。在本文中，我们发现在UBC患者尿液外泌体中HOTAIR和几个肿瘤相关lncRNAs丰度有所提高。在UBC细胞系中特异性敲低HOTAIR可以抑制细胞在体外的迁移和侵袭能力，改变上皮到间质转化（EMT）的基因，包括SNAI1，TWIST1，ZEB1，ZO1，MMP1 LAMB3和LAMC2表达。这些数据，表明尿液来源外泌体中的lncRNA具有作为生物标志物和治疗靶点的潜力。
参考文献：Chi Lam Au Yeung. Exosomaltransfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovariancancer cells through targeting APAF1Nature Communications,2016.
2.外泌体与miRNA
细胞分泌物刺激是基于干细胞的治疗性诱导血管生成的重要机制，近些年细胞释放的微囊泡被发现在细胞向血管内皮细胞或平滑肌细胞分化过程中具有介导细胞间通讯的重要作用。本研究的目的在于探索干细胞来源的微囊泡对治疗性血管生成的影响。我们第一次观察到的脂肪来源干细胞（ASCs）分泌的微囊泡能够增加人脐带血内皮细胞的迁移和管腔形成。体外实验表明，内皮分化培养基预处理的脂肪来源干细胞微囊泡的分泌能力会提高，囊泡诱导血管生成的能力也会加强。RNA分析表明，ASCs释放的微囊泡中含有miRNA和内皮分化培养基预处理的ASCs分泌的微囊泡中miR-31的含量会上升。进一步的研究显示微囊泡中的miR-31能够促成内皮细胞的迁移和管形成，小鼠主动脉环微血管生长和血管形成。此外，HIF-1，一个抗血管生成的基因，被认定是m iR-31在血管内皮细胞靶mRNA。我们的研究结果表明 ，ASCs来源的微囊泡，尤其是内皮分化培养基预处理后ASCs分泌的微囊泡可以通过miR-31促进血管生成。
参考文献：TingK.Adipose-derived stem cells induce an-giogenesis via microvesicle transport ofmiRNA-31 .Stem Cells Translational Medicine,2016.
3.外泌体与circRNA
circular RNAs是一类广泛存在的环状闭合的非编码RNA，可在体内调控基因的表达。外泌体是一类由细胞分泌的膜状囊泡结构，其内部含有丰富的物质，包括miRNAs, lncRNA,和circRNAs。外泌体中是否能检测到稳定存在的circRNA，能否作为疾病诊断的biomarker，该研究通过一系列实验进行了探索。证明CircRNAs在外泌体中是表达丰富和稳定的，可以作为肿瘤检测的潜在biomarker。
该研究首先对肝癌细胞系分离外泌体进行了circRNA检测，表明细胞分泌外泌体中存在着丰富的circRNAs。随后对健康人血清来源外泌体进行了检测，表明血清外泌体中稳定的circRNAs是可能作为诊断biomarker。进一步的小鼠肿瘤模型和临床直肠癌病人样本血清外泌体的circRNAs检测表明，检测血清外泌体中的circRNA作为临床诊断的biomarker是可行的。
参考文献：Li Y, Zheng QP, Bao CY, et al. Circular RNAis enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.Cell Res. 2015, 25(8):981-4.
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